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Utilisation du milieu INRA96

Niveau de technicité :

Auteurs : M. Magistrini, F. Cuir, F. Méa, M. Caillaud, I. Barrier
Mise à jour Juillet 2013

 

Mis au point et breveté par l'INRA, le milieu INRA 96 est un milieu mis au point pour conserver de la semence à 4 ou 15 ºC. Il est prêt à l'emploi.

Rappel des grands principes de base sur la dilution de semence dans les différents milieux

1°/ Dilution rapide du sperme pur tout en évitant les chocs mécaniques et thermiques (dans un bain marie à 35°c )

2°/ Nombre de spermatozoïdes minimum par dose d’insémination :

  • 200x 106 de spermatozoïdes totaux en insémination artificielle immédiate ( IAI )  et réfrigérée transportée (IARP)< à 12h00 ;
  • 200 à 400x 106 spermatozoïdes totaux en IA réfrigérée transportée ( IART) > à 12h00 (selon les étalons) ;  
    (En insémination artificielle de semence congelée, le nombre de spermatozoïdes totaux est de 400x 106.)


3°/
Dilution minimum : 1 volume de sperme maximum pour 2 volumes de milieu minimum.  Ceci afin d’éviter l’effet négatif du plasma séminal.

4°/ Volume de la dose d’insémination artificielle de semence fraîche ou réfrigérée compris entre 10 et 20 ml.


Les différents protocoles de conservation de la semence tiennent compte des essais et des résultats in vitro et in vivo obtenus à l’INRA de Nouzilly (unité Physiologie de la Reproduction et des Comportements), dans les centres techniques et les centres expérimentaux des Haras Nationaux, depuis de très nombreuses années.


Voir aussi le Guide Pratique d’Insémination Artificielle pour plus de détails.

 

Caractéristiques du milieu INRA96

©IFCE

Le milieu INRA96 est composé d’une solution de sels et de sucres ainsi que de la fraction purifiée des caséines du lait ou PPCN (phosphocaséinate natif). Ce milieu contient des antibiotiques aux concentrations habituellement utilisées (cf. Guide Pratique d’Insémination Artificielle Equine) c’est-à-dire 50UI/mL de pénicilline et 50µg/mL de gentamicine ; de plus il contient un antifongique, l’amphotéricine B (0,25µg/mL) (Batellier et al., 1997).

Il a montré son efficacité après 24 heures de conservation à la température de 15°C et 4°C. Les résultats obtenus après 24 heures de conservation (résultats de 1994 à 1996) montrent que la fertilité de certains étalons a été améliorée par la conservation de la semence à 15°C (Batellier et al., 1998). Ceci laisse envisager une alternative pour les étalons dont la semence ne supporte pas les effets néfastes du «cold shock» lors de la descente de température à 4°C. Ces résultats permettent d’envisager, selon les besoins, et en fonction de la qualité de la semence des étalons, d’utiliser le milieu INRA96 à la fois à la température de 15°C et de 4°C.

Par ailleurs, les résultats obtenus après 72 heures de conservation laissent envisager la possibilité de conserver la semence dans le milieu INRA96 pendant plus de 24 heures avant insémination (Batellier et al., 2001) tout en maintenant la fertilité (Chanavat et al., 2005 ; Vidament et al., 2005).

Stockage du milieu INRA96


Le milieu INRA96 peut être transporté à température ambiante n’excédant pas 30°C. Pour un stockage prolongé, il est par contre nécessaire de le conserver entre +2°C et +8°C.


Remarques :

  • Lors de l’ouverture d’un flacon, si la totalité du milieu n’est pas utilisé, il est possible de le fractionner dans des tubes stériles et de le congeler. Cependant, un seul cycle de congélation est acceptable. Lorsque le milieu a été congelé, il est recommandé de le décongeler à l’eau chaude (environ 40°C) et éviter de l’agiter violemment (problème de « mousse »).

  • Il faut prévoir de décongeler le milieu avant de commencer à collecter l’étalon (prévoir de 15 à 50 minutes en fonction du volume de milieu et de la température de décongélation) ; par exemple il faut compter  42 minutes pour un flacon de 200 ml et 28 minutes pour un tube «Corning» de 45 ml lors de décongélation dans le bain-marie à 35°C. Il est possible de décongeler le milieu à une température supérieure (environ 45°C).

Préparation des doses d’insémination

©INRA/IFCE

Le protocole de préparation de doses d’IA avec le milieu INRA96 ne diffère que peu ou pas de celui utilisant tout autre milieu de dilution en vue d’insémination artificielle de semence fraîche, réfrigérée avec ou sans transport de doses.

  • Déterminer le nombre de doses d’inséminations à préparer, prélever le volume de milieu nécessaire et le mettre au bain marie à 35°C en attendant la collecte de la semence. Si n doses d’insémination sont nécessaires, prélever n+1 x10mL de milieu.

  • Collecter la semence, la filtrer puis évaluer sa concentration en spermatozoïdes à l’aide du photomètre.

  • Diluer la semence à la concentration finale de 20x106 spermatozoïdes par mL ou moins en fonction de la concentration de la semence pure de l’étalon.

  • Conditionner la semence diluée en doses de 10mL (ou plus en fonction de l’étape précédente) pour l’inséminer immédiatement ou la conserver en vue d’inséminations différées.


Il est à noter que l’ensemble des résultats obtenus à Nouzilly lors d’IA différées 24H ou plus l’ont été avec des doses de 200 Millions de spermatozoïdes totaux.

Conditionnement de la semence après dilution dans le milieu INRA96

Une des caractéristiques du milieu INRA96 est de permettre de conserver la semence à la température de 4°C ou 15°C ; cependant le conditionnement diffère en fonction de la température.

Remarque importante : ne pas utiliser de seringues dont le piston comporte un joint d’étanchéité en caoutchouc butyl noir (problème de toxicité vis à vis des spermatozoïdes)

Conservation à 4 °C

La semence diluée doit être conservée en condition anaérobie (cf figure ci-dessous). Prélever 10mL de semence diluée dans une seringue de 20mL puis éliminer l’air résiduel.

A cette température, il existe des containers autonomes qui maintiennent la température à 4°C ; le transport est alors possible.

Conservation à 15°C

La semence diluée doit être conservée en condition aérobie (cf figure ci-dessous). Prélever 10mL de semence diluée dans une seringue de 20mL puis aspirer 10mL d’air. Stocker la seringue à l’horizontale.

A cette température, il n’existe pas de containers autonomes qui maintiennent la température à 15°C.


Il est recommandé de contrôler régulièrement la température de conservation en utilisant une sonde enregistreuse.

Références bibliographiques

Références bibliographiques spécifiques milieu INRA96

BATELLIER F., DUCHAMP G., YVON J.M., VIDAMENT M., ARNAUD G., MOUYSSET C., VINCENT P., PALMER E., MAGISTRINI M., 1997a. Mise au point d'un dilueur chimiquement défini pour l'insémination artificielle immédiate ou différée. 23ème Journée d'Etude, 26 février 1997, Paris, 97-105.

BATELLIER F., MAGISTRINI M., FAUQUANT J., PALMER E., 1997b. Effect of milk fractions on survival of equine spermatozoa. Theriogenology, 48, 391-410.

BATELLIER F., DUCHAMP G., VIDAMENT M., ARNAUD G., PALMER E., MAGISTRINI M., 1998. Delayed insemination is successful with a new extender for storing fresh equine semen at 15°C under aerobic conditions. Theriogenology 50, 229-236.

BATELLIER F., VIDAMENT M., DUCHAMP G., ARNAUD G., YVON, JM., FAUQUANT J., MAGISTRINI M., 2001. Advances in cooled sperm technologies. An. Reprod. Sci., 68 (3-4) 181-190.

BATELLIER F., VIDAMENT M., DUCHAMP G., ARNAUD G., YVON, JM., FAUQUANT J., MAGISTRINI M., 2001. L’INRA96â, un milieu de conservation de la semence d’étalon aux température de 4°C et 15°C. 27ème Journée de la Recherche Equine, Paris, 7 mars,15-21.

VIDAMENT M., DUCHAMP G., SPALART M., YVON J.M., BRUNEAU B., MARGAT A., SPEZIANI B., LEVILLAIN N., MAGISTRINI M., 2005. Fertilité du sperme d'étalon conservé de 24 à 72 H dans l'INRA96â : stratégie d'insémination et température de conservation. 31ème Journée de la Recherche Equine, les Haras Nationaux, 2 mars 2005, Paris , 93-103.


Références bibliographiques sur les techniques d’insémination artificielle

BATELLIER F., VIDAMENT M., NOUE P., CLEMENT F., MAGISTRINI M., PALMER E., 1998. Les techniques d'insémination artificielle. Le Point Vétérinaire, 29, (189), 53-59.

MAGISTRINI M., 1999. L’insémination artificielle chez les équins. Dossier : Actualités en Reproduction Equine. INRA, Productions Animales, 12 (5), 347-349.

MAGISTRINI M., VIDAMENT M., 1999. L’insémination artificielle équine : des technologies à géométrie variable. 25ème Journée de la Recherche Equine, Paris, 3 mars, 117-128.
Guide Pratique d’insémination Artificiel, Edition 2010 (vérifier référence)

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